材料与方法

^{应用核酸酶免疫中探针的熔解温度检测已知突变位点}

^李^稻^杨卫华^段宝华^李建新^杭^勤^程新建^王鸿利

^{【摘要】目的}^{探索建立一种利用核酸酶免疫中探针的熔解温度差异检测已知突变位点的方法。方法目的靶基因核酸扩增后，5}^’^{末段标记Digoxigenin (Dig)的等位基因探针与已结合在酶标板上的扩增产物杂交，其杂交的探针－DNA二聚体的碱基错配与未错配之间存在变性温度差异。选择适宜的熔解温度进行已知突变位点的检测，并利用酶联免疫方法对标记探针进行识别、放大和结果判断。
结果实验结果表明，当熔解温度为37℃时，扩增产物的加样量为 5μl/孔和检测探针加入量为 10pmol/孔时所测得A450值在0.800～0.923之间。等位基因检测探针(P1、P2)的熔解温度为53℃，P1、P2与靶DNA结合率分别是86%和16%。当P1、P2按不同比例杂合时，其结合率存在着明显的线性关系(r=0.9985)。从8例临床HBV
DNA阳性的标本检测中证实1例 YVDD突变、3例野生型，其余4例可能是杂合型突变。结论本方法具有较高的检测灵敏度，而且其突出的特点是能检测出标本中杂合突变所占的比例，间接反映出患者体内突变的类型和比例。这对于疾病的诊断、治疗、评价预后等都具有较高的价值。}

^{【关键词】}^{乙型肝炎病毒}^{聚合酶链反应酶联免疫检测突变 YVDD}

在众多导致人类疾病的遗传基因有义突变和病原体耐药基因的有义突变中，单个碱基突变占了相当大的比例^[1]，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变的检测，将是临床进行基因诊断的重要手段之一。在过去十多年中，曾出现了诸如经典的PCR—RFLP、ASO、OLA、COP、PEX等点突变的测定方法，以及近年出现的iRSM、ASPCR、FRET、Gene Chip等新的测定方法。本文将探索建立一种新的检测已知突变位点的方法。本方法依据PCR-ELISA过程中标记探针与靶DNA杂交的稳定性取决于其变性温度（Tm值）的原理，设计一对3’末端存在1个碱基差异的等位基因探针，选择适宜的熔解温度，观察单个位点碱基差异对PCR-ELISA检测结果的影响。另外对HBV YVDD突变的血清标本进行初步测定。

^{材料与方法}

^一．材料

上海第二医科大学、上海市医学检验重点实验室。

^{1．标本来源：}

^{（1）HBV DNA 全基因重组质粒，由adr型HBV全基因经BamH I酶切后克隆至pBR322载体,以常规方法转染、扩增和提取。}

^{（2）5例Lamivudine治疗后HBV DNA仍阳性血清标本来自上海市传染病医院,
3例HBV感染的乙肝患者血清标本均3年前采集。}

^{2．寡核苷酸引物：系自行设计两对引物(表1)，由上海生工生物工程公司合成。}

^{表1. HBV保守区片段与YIDD突变区片段扩增的引物设计}

^{HBV保守区片段(S区1943-1962) YIDD突变区片段(S区2047-2590)}

^{长度碱基序列
长度碱基序列}

^上游引物^{19bp 5}^’^{Bio-CAATCTTCTCGAGGACTGG-3}^’^{20bp 5}^’^{Bio-ATCCTCACAATACCACAGAG-3}^’

^下游引物^{20bp 5}^’^{-AGGACAAACGGGCAACATAC-3}^’^{22bp 5}^’^{-CAGACTAGGCCCCCAATACCAC-3}^’

^{3．突变点检测探针：系自行设计，探针互补区位于上述各自扩增片段内，其5′端均标记Digoxigenin，由上海生工生物工程公司合成。序列如下：}

^{（1）等位基因探针}

^{P1：5′-AAGATGAGGCATAGCAGC-3′}

^{P2：5′-AAGATGAGGCATAGCAGA-3′}

^{P1与P2是等位基因探针（ASO），其唯一的差异是3′末端C→A。P1与靶DNA完全匹配，Tm=54℃[计算公式：T=4(G+C)+2(A+T)]；P2的3′末端A与靶DNA的G发生错配，错配后Tm=50℃。}

^{（2）YIDD突变检测探针}

^{P3: 5′-ACTAGTAAACTGAGCCAG-3′Tm=52℃}

^{P3的突变检测区域位于HBV基因第2488位（669位[2]）}

^{4．Taq酶、dNTP、链酶亲和素（Streptavidin,SA）购自普洛麦格公司；辣根过氧化物酶标记的抗Dig抗体购自宝灵曼公司。}

^二、方法

^{1．血清标本处理[3]：血清处理后，其HBV DNA抽提液作为PCR扩增的模板。}

^{2. PCR扩增反应：扩增反应总体积为25μl，其中包括Biotin标记的上游引物及其下游引物各1.0μmol/L，四种dNTP均为100μmol/L，Taq
DNA聚合酶1单位，MgCl22.5mmol/L,1xPCR缓冲液(10mmol/L pH8.8 Tris-HCl，50mmol/L KCl，0.08% NP40)，反应模板为稀释的HBV重组质粒或血清抽提液，均4μl。混匀后稍加离心，置于基因扩增仪中进行94℃/120S；94℃/30S，60℃/60S，72℃/35S，共40Cycle；72℃/300S扩增。}

^{3. SA包被酶标板的制备：见参考文献[3]}

^{4．已知突变点测定：SA酶标板用洗涤液(pH7.4
0.01mmol/L PBS 0.05% Tween-20)洗1次3min，拍干备用。PCR扩增产物5μl，将其与杂交液[0.6mol /L NaCl，pH7.4
0.02mol/L PB，1mmol/L EDTA, 1×Denhardt (0.02% PVP, 0.02% BSA,0.02% Ficoll 400)]1：10稀释后，以50μl/孔加到SA酶标板孔中，室温轻摇15
min，弃反应液，用洗涤液洗3次，每次3 min。加入 50μl/孔 0.1 mol/L NaOH，室温反应10min。弃反应液，用0.1mol/L NaOH洗1次，pH7.5
0.1 mol/L Tris-HCl洗3次，每次3 min。加入含探针（10pM/50μl）的杂交反应液，每孔50μl。然后，置于52℃水浴2小时进行杂交，完毕后，洗涤液洗2次，每次3min,再用pH7.5
0.1mol/L Tris-HCl洗2次，每次3min。此时,酶标板中再加入pH7.5 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液100μl/孔，将每组的对照孔置于37℃水浴，其余孔按要求放入不同温度的水浴中，}同时水浴10min进行检测探针熔解反应。结束后，应立即弃除孔内反应液，洗涤3次，每次3min。加入稀释的抗dig酶标抗体（^50μl/孔），37℃水浴1小时后洗3次，每次3min, 拍干。加底物TMB（^{50μl/孔），室温显色}，15min后用2mol/L H₂SO₄终止反应，450nm下测定光吸收度（A₄₅₀值）。

检测探针结合率计算：

探针结合率（%）=熔解温度A₂₆₀值/ 37℃温度A₂₆₀值(自身对照)×100%。

结果

一．最适检测条件选择

1. 扩增产物加样量的选择

为了使扩增产物与SA酶标板的结合最佳，将对其加样量进行调整，使其在SA酶标板中加入依次为1：2.5、1：5、1：10、1：20稀释的PCR扩增产物50μl/孔。通过杂交酶联测定，37℃水浴熔解时所得不同比率下所测得的A₄₅₀值结果，如下表2所示：

表2.扩增产物加样量与探针浓度优化选择（A₄₅₀值）

扩增产物加样量的稀释度探针浓度（μl/50μl/孔）

探针编号 1:2.5 1:5 1:10 1:20 2μl 4μl 8μl 16μl

P1 0.178 0.347 0.831 0.530 0.923 0.792 0.500 0.535

P2 0.259 0.296 0.858 0.860 0.821 0.752 0.849 0.855

根据表２所示1：10时A₄₅₀值最高，说明此时扩增产物与酶标板的SA结合率最适宜。而1：2.5和1：5稀释时，可能由于酶标板SA结合扩增产物过多，反而阻碍检测探针的结合，产生了所谓的“密林”效应。

2．检测探针浓度的选择

在核酸扩增40个循环和SA酶标板结合扩增产物最适基础上，检测探针（5pmol /μl）加入量依次为2μl、4μl、8μl、16μl/50μl/孔。探针杂交后，再放入37℃水浴10min，不同探针量所测得的A₄₅₀值结果如表2所示。结果表明：加入2μl检测探针，获得A₄₅₀值最高。

3．熔解温度的选择：

P1● ●

P2▲ ▲

按上述实验步骤，选用P1、P2等位基因探针，其熔解温度分别设定为49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃水浴10min，不同温度下两组检测探针相对于37℃时结合率结果如图1所示：

从图1可以看出，53℃时两者与靶DNA结合率相差较大（P1=86%与P2=16%），因此用53℃作为熔解温度，其检测效果最佳。

二．53℃熔解的稳定性观察

上述条件下，进行P1、P2等位基因探针53℃熔解的检测稳定性观察。同一样品、同一检测条件、不同时间内所测得结果如下（表3）：

表3 53℃熔解温度时等位基因探针结合率稳定性观察

检测次数等位基因探针结合率（%）

探针类型（n） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 `c ± SD

^P1 12 94 80 100 75 73 75 91 82 89 97 80 90 86±9.18

^P2 12 11 8 16 6 10 8 17 12 12 16 18 10 12±3.76

三、杂合型等位基因探针检测

^{P1、P2按一定比例混合（100%P1、3：1、1：1、1：3、100%P2）形成杂合型等位基因检测探针，其检测结果如表4所示：}

^{表4.杂合型等位基因探针的检测结果}

^{探针杂合比例（P1：P2）}

^{(P1)1:0
3:1 1:1 1:3 0:1(P2)}

^{结合率（%） 89 69 53 25 13}

^{结合率（%） 88 69 52 35 17}

^平均值(`c)^{88.5 69 52.5 30 15}

结果表明：已知的等位基因检测探针的不同比例杂合，测得的结合率可构建一条杂合探针比例曲线（图2）。

四．临床乙肝患者HBV YVDD突变的检测^[2，5]

乙肝患者血清中提取HBV DNA，作为模板进行核酸扩增，SA酶标板捕获扩增产物，^{P3检测探针与其杂交。如HBV
DNA存在YVDD点突变，熔解温度在47℃时P3检测探针与靶DNA完全脱结合；如未发生YVDD点突变时，47℃条件下P3检测探针不发生熔解。以此，检测患者标本中是否存在Lamivudine的耐药基因，所测结果如表5所示：}

^{表5.HBV YVDD突变标本的检测结果}

^{标本编号 1 2 3 4 5 6 7 8}

^{结合率（%） 54 33 21
100 90 100 72 59}

实验结果显示： 4、5、6号标本的P3检测探针结合率接近或等于100%，而3号标本的结合率则较低。这表明4、5、6号标本均为HBV野生型，3号标本存在HBV YVDD点突变，其结果与sequence分析相一致。1、2、7、8号标本可能是杂合型突变，用错位PCR（ARMS）检测证实存在YVDD点突变。

讨论

在众多导致人类遗传疾病的基因有义突变和致病微生物的耐药基因有义突变中，单个碱基位点突变占了相当大的比例^[1]。其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变点的检测，将是临床进行基因诊断的重要手段之一。近年来，随着新技术、新仪器的不断出现，诞生了多种检测点突变的新方法，诸如：利用荧光特性的FRET结合融合曲线分析法^[2,4]；Kobayashi 等人用微测序技术作为检测手段，将PCR-ELISA作为信号放大识别系统检测乙肝患者中Lamivudine的耐药基因^[5]。

经典的等位基因特异性寡核苷酸检测技术（ASO）是利用Tm值的差异能进行单个位点突变的检测。有资料显示^[6]：探针长度小于20bp时，1个碱基差异便会使DNA分子的Tm值下降5～7.5℃。本实验就利用检测探针与靶DNA杂交后，错配与匹配之间存在的Tm值差异，通过严格控制熔解温度进行点突变检测。PCR-ELISA作为一种经济、实用的信号放大识别系统，近年来也广泛地应用于基因诊断。与ASO相似，本实验建立的PCR酶联杂交法检测基因点突变方法，依赖于匹配与错配的探针-DNA二聚体在热稳定性上的差异。实验结果证实，这种热稳定性与Watson-Crick配对和熔解温度有较密切关系。此外，杂交后探针-DNA二聚体的热稳定性还与其双链长度、GC含量、碱基序列、错配的位置及其邻近的碱基对相关^[7，8,9.10]。短核苷酸序列的不稳定性明显大于长核苷酸序列，因而一般探针的设计长度为20bp左右。由于碱基错配中G：T相对比较稳定，检测此错配位点时，可在邻近引入错配碱基对，使探针-DNA二聚体的不稳定性增加，或用其互补链作为模板进行检测。另外，错配碱基对距离寡核苷酸中心越近与完全匹配探针的Tm值相差越大，即不稳定性越高，但本方法将错配碱基置于检测探针的3′末端，两者的熔解温度也相差3～4℃。

对8例临床标本进行检测，检出1例突变型、3例野生型，4例杂合型突变，这表明本方法在突变检测中不仅能定性，而且还能确定是否存在杂合型突变。如果将已知杂合比例的突变基因标准品的检测结果作一条标准曲线，据此曲线就可能判断被检标本中突变基因所占的比例。

本研究建立的单个位点突变检测方法，无需特殊仪器和设备，非常适合实验室采^{用。对于靶DNA低拷贝时，可以通过最佳条件核酸扩增获得扩增产物，进而提高点突变基因的检出率。另外，本方法能检测出杂合型突变标本中突变基因所占的比例，间接反映出患者体内突变基因所占比例。这些对于疾病的诊断、治疗、评价预后等都具有较高的价值。}

参考资料

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2．Cane PA, Cook P, Ratcliffe D, et al. Use of real-time PCR and fluorimetry to detect lamivudine resistance-associated mutation in hepatitis B virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1999; 43: 1600-1608

3. 顾文莉，李稻，黄冬生，等. 酶联杂交法定量检测乙型肝炎病毒。中华医学检验杂志. 1999;22（3）：164-165.

4. Bernard PS, Lay MJ, et al. Integrated amplification and detection of the C677T point mutation in methylenetetranhydrofolate reductase gene by fluorescence resonance energy transfer and probe melting curves. Analytical Biochemistry. 1998;225：101～107

5．Kobayashi S, Ide T, Sata M. 　Detection of YMDD motif mutations in some lamivudine-untreated asymptomatic hepatitis Bvirus carriers. J Hepatology 2001 ; 34 : 584-586

6. Wallace RB, et al. The use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes. Ⅱ. Hybridization of oligonucleotides of mixed sequence to rabitt β-globin DNA. Nucleic Acids Res. 1981; 9 : 879-894

7. Kneale G, Brown T, et al. G:T Base-pairs in a DNA Helix:The Crystal Structure of d(G-G-G-G-T-C-C-C). J Mol Biol . 1985; 186 : 805-814

8. Werntges H, Steger G, et al. Mismatches in DNA double strands: thermodynamic parameters and their correlation to repair efficients.

Nucleic Acids Res. 1986; 14 : 3773-3790

9. Ke SH, Wartell RM, et al. Influence of nearest neighbor sequence on the stability of base pair mismatches in long DNA:determination by temperature-gradient gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 1993; 21 : 5137-5143

10. Maeda Y, Nunomura K, Ohtsubo E, et al. Differential Scanning Calorimetric Study of the Effect of Intercalators and other Kinds of DNA-binding Drugs on the strepwise Melting of Plasmid DNA. J Mol Biol. 1990; 215 : 312-329

^{Detection of Known Point
Mutation Using Probe/Production Duplex Melting Temperature by PCR-ELISA}

Li Dao, Yang Weihua, Duan Baohua, Li Jianxin, Hang Qin, Cheng Xinjian,

Wang Hongli.

(Shanghai Municipal key laboratory of Medical Testing Technology, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200023)

^{Abstract: Objective}^{To establish a method of detection of
known point mutation using melting temperature difference of probe/production
duplex by PCR-ELISA(nucleotide amplification and enzyme immunoassay). Methods After target DNA was amplified, the 5}^’^{-digoxin-labeled probes of allelic gene were hybridized
with amplified products captured in microplate wells. In the hybridization of
DNA, the probe/production duplex melting temperature was differed from matching
alkali base and mismatching alkali base. Proper melting temperature was
selected to detect known point mutation, and the hybridized probes was enlarged
and identified by the method of enzyme immunoassay. Results The absorptions at 450nm were 0.800~0.923 under
circumstances that added amplified products 5μl per well, detection probe
10pmol per well and melting temperature was at 37℃. When probe melting
temperature of allelic gene was at 53℃, the hybridization ratios with target
DNA for probe 1 and probe 2 were 83% and 18% respectively. When probe 1 and
probe 2 were mixed with different
proportion, hybridization ratios had good linear correlation with ratios of
probe 1 and probe 2（r=0.9985）. Result detected by the described method showed
that 1 was YVDD mutation,4 were heterogeneous mutation and other 3 were wild
from 8 cases of HBV DNA positive clinical specimens. Conclusions The described method had good sensitivity and could be
used to detect heterogeneous mutation.}

Key words : HBV PCR ELISA ^{mutation YVDD}